Vad är polymerasekedjereaktion (PCR)?

PCR står för polymeraskedjereaktion , en molekylärbiologiteknik för amplifiering av segment av DNA, genom att generera flera kopior med användning av DNA-polymerasenzymer under kontrollerade betingelser. Så lite som en enda kopia av ett DNA-segment eller en gen kan klonas i miljontals kopior, vilket möjliggör detektering med färgämnen och andra visualiseringstekniker.

Utvecklat 1983 har PCR-processen gjort det möjligt att utföra DNA-sekvensering och identifiera nukleotidernas ordning i enskilda gener.

Metoden använder termisk cykling eller upprepad upphettning och kylning av reaktionen för DNA-smältning och replikation. När PCR fortsätter användes det "nya" DNA som en mall för replikation och en kedjereaktion följer, exponentiellt amplifiering av DNA-mallen.

PCR-tekniker tillämpas inom många områden av bioteknik, inklusive proteinteknik , kloning, rättsmedicin (DNA fingeravtryck), faderskapstestning, diagnos av ärftliga och / eller infektionssjukdomar och för analys av miljöprover.

I kriminalteknik är PCR särskilt användbar eftersom det förstärker även den minsta mängd DNA-bevis. PCR kan också användas för att analysera DNA som är tusentals år gammal, och dessa tekniker har använts för att identifiera allt från en 800 000 årig mammut till mumier från hela världen.

PCR-proceduren är som följer:

• Initialisering: Detta steg är nödvändigt endast för DNA-polymeraser som kräver startstart-PCR. Reaktionen upphettas till mellan 94 och 96 ° C och hålles i 1-9 minuter.

• Denaturering: Om proceduren inte kräver initialisering är denaturering det första steget. Reaktionen upphettas till 94-98 ° C i 20-30 sekunder. DNA-mallens vätebindningar störs och enkelsträngade DNA-molekyler skapas.
• Annealing: Reaktionstemperaturen är lägre till mellan 50 och 65 ° C och hålls i 20-40 sekunder. Primerna annealerar mot den enkelsträngade DNA-mallen. Temperaturen är extremt viktig under detta steg. Om det är för varmt kan primern inte binda. Om det är för kallt, kan primern binda perfekt. En bra bindning bildas när primer-sekvensen nära matchar mallföljden.

• Förlängning / förlängning: Temperaturen under detta steg varierar beroende på typen av polymeras. DNA-polymeraset syntetiserar en helt ny DNA-sträng.
• Slutlig töjning: Detta steg utförs vid 70-74 ° C i 5-15 minuter efter den slutliga PCR-cykeln.
• Slutligt håll: Detta steg är valfritt. Temperaturen hålls vid 4-15 ° C och strömmar reaktionen.

Förfarandet är indelat i tre steg:

• Exponentiell amplifiering: Under varje cykel fördubblas produkt (den specifika DNA-delen som replikeras).
• Nivelleringssteg: Eftersom DNA-polymeraset förlorar aktivitet och förbrukar reagenser, sänks reaktionen.
• Plateau: Ingen mer produkt ackumuleras.