Vilken PCR har att göra med DNA-sekvensering och förstärkande gener
Polymeraskedjereaktionen ( PCR ) är en molekylärgenetisk teknik för att göra flera kopior av en gen och är också en del av gensekvenseringsprocessen.
Hur fungerar polymerasekedjereaktion?
Genkopior görs med ett DNA-prov, och tekniken är tillräckligt bra för att göra flera kopior från en enda kopia av genen som finns i provet. PCR-amplifiering av en gen för att göra miljontals kopior, möjliggör detektion och identifiering av gensekvenser med användning av visuella tekniker baserade på storlek och laddning (+ eller -) av DNA-stycket.
Under kontrollerade betingelser alstras små segment av DNA med enzymer som är kända som DNA-polymeraser, som adderar komplement-deoxinukleotider (dNTP) till en bit DNA som är känd som "mallen". Ännu mindre bitar av DNA, som kallas "primers", används som utgångspunkt för polymeraset. Primers är små konstgjorda bitar av DNA (oligomerer), vanligen mellan 15 och 30 nukleotider långa. De är gjorda genom att känna till eller gissa korta DNA-sekvenser vid de ena ändarna av genen som amplifieras. Under PCR värms DNA-sekvensen upp och de dubbla trådarna separeras. Vid kylning binder primrarna till mallen (kallad glödgning) och skapar en plats för polymeras att börja.
PCR-tekniken
Polymeraskedjereaktionen (PCR) möjliggjordes genom upptäckten av termofiler och termofila polymerasenzymer (enzymer som upprätthåller strukturell integritet och funktionalitet efter upphettning vid höga temperaturer).
Stegen involverade i PCR-tekniken är följande:
- En blandning skapas med optimerade koncentrationer av DNA-mallen, polymerasenzym, primrar och dNTP. Förmågan att värma blandningen utan att denaturera enzymet möjliggör denaturering av dubbelhelixen av DNA-prov vid temperaturer i intervallet 94 grader Celsius.
- Efter denaturering kyles provet till ett mer måttligt område, omkring 54 grader, vilket underlättar annealing (bindning) av primrarna till de enkelsträngade DNA-mallarna.
- I det tredje steget av cykeln uppvärms provet till 72 grader, den ideala temperaturen för Taq DNA-polymeras, för förlängning. Under förlängning använder DNA-polymeras den ursprungliga enkla strängen av DNA som en mall för att tillsätta komplementära dNTP till 3'-ändarna av varje primer och generera en sektion av dubbelsträngat DNA i regionen av genen av intresse.
- Primers som har blivit annealed till DNA-sekvenser som inte är en exakt matchning förbli inte annealed vid 72 grader, vilket begränsar förlängning till genen av intresse.
Denna process av denaturering, glödgning och förlängning upprepas flera (30-40) gånger, varigenom exponentiellt ökas antalet kopior av den önskade genen i blandningen. Även om denna process skulle vara ganska tråkig om den utfördes manuellt kan prover framställas och inkuberas i en programmerbar termocykler, som nu är vanlig i de flesta molekylära laboratorier, och en fullständig PCR-reaktion kan utföras på 3-4 timmar.
Varje detatureringssteg stannar förlängningsprocessen för den föregående cykeln och därmed trunkerar den nya DNA-strängen och håller den till ungefär storleken på den önskade genen.
Varaktigheten av förlängningscykeln kan göras längre eller kortare beroende på storleken på genen av intresse, men slutligen, genom upprepade cykler av PCR, kommer majoriteten av mallar att begränsas till storleken av genen av intresse endast, eftersom de kommer att ha genererats från produkter från båda primrarna.
Det finns flera olika faktorer för framgångsrik PCR som kan manipuleras för att förbättra resultaten. Den mest använda metoden för att testa för närvaron av PCR-produkten är agarosgelelektrofores . Vilket används för att separera DNA-fragment baserat på storlek och laddning. Fragmenten visualiseras därefter med hjälp av färgämnen eller radioisotoper.
Evolutionen
Sedan upptäckten av PCR har andra DNA-polymeraser än den ursprungliga Taq upptäckts. Vissa av dessa har bättre "korrekturläsning" -förmåga eller är stabila vid högre temperaturer, vilket förbättrar PCR-specificiteten och reducerar fel från införandet av felaktig dNTP.
Vissa variationer av PCR har utformats för specifika applikationer och används nu regelbundet i molekylärgenetiska laboratorier. Några av dessa är realtid PCR och Reverse-Transcriptase PCR. Upptäckten av PCR har också lett till utvecklingen av DNA-sekvensering, DNA-fingeravtryck och andra molekylära tekniker.