Justeringar av någon av komponenterna i en reaktion med polymeraserkedjereaktion (PCR) kan förändra utfallets kvalitet, antingen genom att förbättra eller minska produktutbytet och kvaliteten eller genom att förbättra reaktionsspecificiteten och känsligheten. Parametrar som påverkar slutresultatet kan antingen vara fysiska (dvs. temperatur, cykeltider) eller kemiska (dvs. mallkoncentration, typ av enzym som används). Följande är flera viktiga faktorer som påverkar framgången med PCR.
01 Ren laboratorieförhållanden
Eftersom PCR kan detektera en DNA-molekyl, är det viktigt att upprätthålla orena tillstånd i laboratoriet. Använd alltid fräscha handskar, använd sterila glasvaror, rör och pipettips och sterila lösningar och rengör arbetsområdet innan du börjar arbeta.
Ta alltid med kontrollreaktioner, utan mall-DNA och utan enzym, för att säkerställa att resultaten verkligen beror på förstärkning av rätt prov.
De flesta människor ser till att ha en egen uppsättning lösningar som inte delas för att göra felsökning enklare och utsedda pipetter är endast avsedda för PCR. DNase- och RNase-fri PCR-rör, aerosolresistenta pipettspetsar och arbete i en avluftningsdosa med UV-ljus är också sätt att minimera problem.
02 kemiska komponenter
- Har 18 till 24 baser
- Har ingen sekundär struktur (dvs hårnålslingor)
- Har en balanserad fördelning av G / C och A / T-par
- Komplementar varandra inte vid 3-fotsändarna
- Har smältemperaturer (Tm) ca 5-10 grader Celcius under glödgningstemperaturen, som vanligtvis är mellan 55 och 65 grader Celcius
Tm för båda primrarna bör också likna för bästa resultat.
03 Reaktionsblandning: Mall och Primers
Optimal primerkoncentration är mellan 0,1 och 0,6 mikromol / L. Mängden mall varierar beroende på typen av DNA (humant, bakteriell, plasmid).
Med mycket låga mängder mall finns det andra strategier för att förbättra resultat, till exempel ökade cykeltal eller användning av "hot start". Testa alltid nya primers med positiv kontrollreaktion, för att vara säker på att de fungerar under dina specifika experimentella förhållanden.
04 Reaktionsblandning: Enzymaktivitet
Koncentrationen av MgCl2 i reaktionsblandningen kan påverka PCR-resultatet och kan spela en viktig roll vid mer krävande reaktioner. Magnesiumkatjon bildar lösliga komplex med dNTP för att producera det faktiska substratet som polymerasenzymet känner igen.
Lika mängder av alla fyra dNTP bidrar också till att minska polymerasfelhastigheten. Vissa tillsatser, såsom betain, BSA, tvättmedel, DMSO, glycerol och pyrofosfatas kan också påverka enzymspecificitet eller reaktionseffektivitet.
05 Typ av termocykler
När du handlar för laboratorieutrustning, kom ihåg att vissa termocyklar är mindre precisa än andra för att behålla exakta, önskade temperaturer.
Detta är ett område där det går billigt kommer inte att löna sig i det långa loppet när du står inför en finaktig reaktion eller med hjälp av primers som kräver ett smalt område av glödgningstemperatur.
Tunnväggiga reaktionsrör som är utformade för att passa det exakta märket av termocykler du använder, hjälper också till att optimera reaktionstemperaturerna.
06 Cykelinställningar
Ökat utbyte kan uppnås genom att förlängningstiden ökas om 20 cykler, för att kompensera för mindre enzym för att förstärka mer mall. Vanligtvis är mindre än 40 cykler tillräckliga för att amplifiera mindre än 10 mallmolekyler till en koncentration som är tillräckligt stor för att se på en etidiumbromidfärgad agarosgel .