Genkloning är en handling att göra kopior eller kloner av en enda gen. När en gen har identifierats kan kloner användas inom många områden av biomedicinsk och industriell forskning. Geneteknik är processen att klona gener i nya organismer eller ändra DNA-sekvensen för att ändra proteinprodukten. Geneteknik beror på vår förmåga att utföra följande väsentliga förfaranden.
01 Polymeraskedjereaktion
02 Restriktionsenzymer
Upptäckten av enzymer som är kända som restriktionsendonukleaser har varit väsentliga för proteinteknik . Dessa enzymer skär DNA på specifika ställen baserat på nukleotidsekvensen. Hundratals olika restriktionsenzymer , som är kapabla att skära DNA på en distinkt plats, har isolerats från många olika bakteriestammar. DNA skuren med ett restriktionsenzym producerar många mindre fragment, av olika storlekar. Dessa kan separeras med gelelektrofores eller kromatografi.
03 Elektrofores
Rening av DNA från en cellodling eller skärning av det med hjälp av restriktionsenzymer skulle inte vara till stor nytta om vi inte kunde visualisera DNA-det vill säga hitta ett sätt att se huruvida ditt extrakt innehåller något eller hur stor storlek du fragmenterar har klippt in den. Ett sätt att göra detta är genom gelelektrofores. Geler används för en rad olika ändamål, från att titta på skarpt DNA för att detektera DNA-insatser och knockouts.
04 Gå med i två delar av DNA
I genetisk forskning är det ofta nödvändigt att länka två eller flera enskilda DNA-strängar, för att skapa en rekombinant strand eller stänga en cirkulär sträng som har skurits med restriktionsenzymer. Enzymer som kallas DNA-ligaser kan skapa kovalenta bindningar mellan nukleotidkedjor. Enzymerna DNA-polymeras I och polynukleotidkinas är också viktiga vid denna process för att fylla i gap eller fosforylera 5'-ändarna.
05 Val av litet självreplikerande DNA
Små cirkulära bitar av DNA som inte ingår i ett bakteriegenom, men som är kapabla till självreplikation, är kända som plasmider. Plasmider används ofta som vektorer för att transportera gener mellan mikroorganismer. I bioteknik, när genen av intresse har amplifierats och både genen och plasmiden skärs av restriktionsenzymer, ligeras de tillsammans för att generera det som är känt som ett rekombinant DNA. Virus (bakteriofag) DNA kan också användas som en vektor, liksom kosmider, rekombinanta plasmider innehållande bakteriofaggener.
06 Metod för att flytta en vektor till en värdcell
Processen att överföra genetiskt material på en vektor, såsom en plasmid, till nya värdceller, kallas transformation. Denna teknik kräver att värdcellerna utsätts för en miljöförändring som gör dem "kompetenta" eller tillfälligt permeabla för vektorn. Elektroporation är en sådan teknik. Ju större plasmiden desto lägre effektivitet med vilken den tas upp av celler. Större DNA-segment klones lättare med användning av bakteriofag, retrovirus eller andra virala vektorer eller kosmider i en metod som kallas transduktion. Fag- eller virusvektorer används ofta i regenerativ medicin men kan orsaka införande av DNA i delar av våra kromosomer där vi inte vill ha det, vilket orsakar komplikationer och till och med cancer.
07 Metoder för att välja transgena organismer
Inte alla celler kommer att ta upp DNA under transformation. Det är viktigt att det finns en metod för att upptäcka de som gör det. Generellt bär plasmider gener för antibiotikaresistens och transgena celler kan väljas baserat på uttryck av dessa gener och deras förmåga att växa på media innehållande det antibiotikumet. Alternativa metoder för selektion beror på närvaron av andra reporterproteiner, såsom x-gal / lacZ- systemet, eller grönt fluorescensprotein, vilket medger val baserat på färg och fluorescens.