Den grad av proteinrenhet som krävs beror på den avsedda slutanvändningen av proteinet.
För vissa tillämpningar är en rå extrakt tillräcklig. För andra användningsområden, såsom i livsmedel och läkemedel, krävs dock en hög renhetsgrad. För att uppnå detta används flera proteinreningsmetoder typiskt i en serie reningssteg.
Varje proteinreningssteg resulterar vanligen i viss grad av produktförlust. Därför är en ideell proteinreningsstrategi en där den högsta reningsnivån uppnås i de minsta stegen. Valet av vilka steg som ska användas beror på storleken, laddningen, lösligheten och andra egenskaper hos målproteinet. Följande tekniker är mest lämpliga för rening av ett enda cytosoliskt protein. Rening av cytosoliska proteinkomplex är mer komplicerat och kräver vanligtvis att olika metoder tillämpas.
Första steget för proteinrening
Det första steget i att rena intracellulära (inuti cellen) proteiner är beredningen av ett orent extrakt .
Extraktet kommer att innehålla en komplex blandning av alla proteiner från cellcytoplasmen och några ytterligare makromolekyler, kofaktorer och näringsämnen. Det råa extraktet kan användas för vissa tillämpningar inom bioteknik, men om renhet är ett problem måste efterföljande reningssteg följas.
Råprotein extrakt framställs genom avlägsnande av cellulära skräp genererade av celllys, vilket uppnås med användning av kemikalier och enzymer , sonikering eller en fransk press. Skräpet avlägsnas genom centrifugering och supernatanten utvinns. Råberedningar av extracellulära proteiner kan erhållas genom att helt enkelt avlägsna cellerna genom centrifugering.
För vissa bioteknikapplikationer är det en efterfrågan på termostabila enzymer : Enzymer som kan tolerera höga temperaturer utan denaturering och samtidigt behålla en hög specifik aktivitet. Organismer som producerar dem kallas ibland extremofiler. En enkel metod för att rena ett värmebeständigt protein är att denaturera de andra proteinerna i blandningen genom upphettning och sedan kyla lösningen (så att det termostabila enzymet kan reformeras eller omlösas om nödvändigt. De denaturerade proteinerna kan sedan avlägsnas genom centrifugering.
Intermediära reningssteg
Tidigare var ett gemensamt andra steg för att rena ett protein från ett råxtrakt genom utfällning i en lösning med hög osmotisk styrka (dvs. saltlösningar). Nukleinsyror i det råa extraktet kan avlägsnas genom utfällning av aggregat bildade med streptomycinsulfat eller protaminsulfat.
Proteinutfällning görs vanligen med användning av ammoniumsulfat som saltet.
Olika proteiner kommer att fälla ut i olika koncentrationer av ammoniumsulfat . I allmänhet bildar proteiner med högre molekylvikt i lägre koncentrationer av ammoniumsulfat. Saltutfällning leder vanligen inte till ett högt renat protein men kan hjälpa till att eliminera några oönskade proteiner i en blandning och koncentrera provet. Salter i lösningen avlägsnas sedan genom dialys genom porös cellulosaförlängning, filtrering eller gelutsläppskromatografi.
Moderna bioteknikprotokoll utnyttjar ofta de många kommersiellt tillgängliga kit som ger färdiga lösningar för standardprocedurer. Proteinrening utförs ofta med hjälp av filter och beredda gelfiltreringskolonner. Allt du behöver göra är att följa anvisningarna och lägga till rätt volym av rätt lösning och vänta den angivna tiden när du samlar elueringsmedlet (vad som kommer ut i kolumnens andra ände) i ett nytt provrör.
- Kromatografiska metoder kan appliceras med hjälp av bänkskolonner eller automatiserad HPLC-utrustning. Separation med HPLC kan utföras med omvänd fas, jonbyte eller storleksexkluderingsmetoder och prover som detekteras av diodmatris eller laserteknik.
Proteinvisualisering och utvärdering av rening
- Omvändfas-kromatografi (RPC) separerar proteiner baserat på deras relativa hydrofobiciteter . Denna teknik är mycket selektiv men kräver användning av organiska lösningsmedel. Vissa proteiner är permanent denaturerade av lösningsmedel och kommer att förlora funktionalitet under RPC. Därför rekommenderas inte denna metod för alla tillämpningar, speciellt om det är nödvändigt för målproteinet att behålla aktiviteten.
- Jonbyteskromatografi hänför sig till separation av proteiner baserade på laddning . Kolonner kan antingen framställas för anjonbyte eller katjonbyte. Anjonbytarkolonner innehåller en stationär fas med en positiv laddning som lockar negativt laddade proteiner. Katjonbytarkolonner är de omvända, negativt laddade pärlorna som attraherar positivt laddade proteiner. Eluering av målproteinet / proteinerna görs genom att pH ändras i kolonnen, vilket resulterar i en förändring eller neutralisering av de laddade funktionella grupperna av varje protein.
- Storleksutslagskromatografi ( gelfiltrering ) separerar större proteiner från små eftersom de större molekylerna färdas snabbare genom den tvärbundna polymeren i kromatografikolonnen. De stora proteinerna passar inte in i porerna i polymeren, medan mindre proteiner gör det och tar längre tid att resa genom kromatografikolonnen via deras mindre direkta väg. Eluat uppsamlas i en serie rör som separerar proteiner baserat på elueringstid. Gelfiltrering är ett användbart verktyg för att koncentrera ett proteinprov eftersom målproteinet uppsamlas i en mindre elueringsvolym än vad som ursprungligen tillsattes till kolonnen. Liknande filtreringstekniker kan användas vid storskalig proteinproduktion på grund av deras kostnadseffektivitet.
- Affinitetskromatografi är en väldigt användbar teknik för "polering" eller fullbordande av proteinreningsprocessen. Pärlor i kromatografikolonnen är tvärbundna till ligander som binder specifikt till målproteinet. Proteinet avlägsnas sedan från kolonnen genom sköljning med en lösning innehållande fria ligander. Denna metod ger det renaste resultatet och den högsta specifika aktiviteten jämfört med andra tekniker.
- SDS-PAGE är polyakrylamidgelelektrofores, utförd i närvaro av SDS (natriumdodecylsulfat) som binder till proteiner som ger dem en stor netto negativ laddning. Eftersom avgifterna för alla proteiner är ganska lika separerar denna metod dem nästan helt baserat på storlek. SDS-PAGE används ofta för att testa renheten av protein efter varje steg i en serie. När oönskade proteiner gradvis avlägsnas från blandningen reduceras antalet band visualiserade på SDS-PAGE-gelen tills det endast finns ett band som representerar det önskade proteinet.
- Immunoblotting är en proteinvisualiseringsteknik applicerad i kombination med affinitetskromatografi. Antikroppar för ett specifikt protein används som ligander på en affinitetskromatografikolonn. Målproteinet bibehålls på kolonnen, avlägsnas sedan genom att skölja kolonnen med en saltlösning eller andra medel. Antikroppar kopplade till radioaktiva eller färgämne-medel hjälper vid detektering av målproteinet när det är separerat från resten av blandningen.
källor:
Zubay G. 1988. Biochemistry, 2nd Edition. Macmillan Publishing Co., New York, NY, USA.
Amersham Pharmacia Biotech. 1999. Proteinreningshandbok, utgåva AB. Amersham Pharmacia Biotech Inc., New Jersey, USA. http://www.biochem.uiowa.edu/donelson/Database%20items/protein_purification_handbook.pdf.